转录因子(Transcription Factor)可分为转录激活子(Transcription Activator)和转录抑制子(Transcription Repressor)两大类(杜娟等, 2008)。转录抑制子是起负调控作用的反式作用因子，具有防止激活子过度激活，保证基因能够在最适的水平上表达，避免过度表达对植物本身造成伤害或能量 浪费的功能(Hanna-Rose et al., 1996)。EAR型转录抑制子(EAR-type Transcriptional Repressor)是指含有EAR基序(ERF-associated amphiphilic repression motif EAR-motif) (Ohta et al., 2001)或类EAR基序的一类植物特有的转录抑制子。研究发现它们普遍存在于植物体内多个蛋白家族中，在植物生长、发育、抗逆和抗病等生理过程的调节及 多种生理过程之间关系的协调(Hiratsu et al., 2002; Kazan et al., 2006; Ciftci-Yilmaz et al., 2007)等方面发挥着重要作用。

2003年，Hiratsu等运用基因工程手段在激活子C末端附加一段EAR基序，融合形成嵌合蛋白，将其转变为高效的负调控子，从而提出了嵌合抑制子基 因沉默技术(Chimeric Repressor Silencing Technology, CREST)。后来研究表明，该技术在转录激活子功能的快速鉴定、研究蛋白质间的相互作用和农作物性状的改良等研究领域有着广阔的应用前景。为了促进对 EAR型抑制子抑制作用机理的认识，促进CREST技术的发展完善，本文对有关EAR型转录抑制子概念、功能和调控机制，以及CREST技术原理和应用进 行综述。

1 EAR型转录抑制子的发现及概念
Fujimoto 等(2000)克隆出了5个编码拟南芥(Arabidopsis thaliana At)ERF(Ethylene responesive factor)蛋白的cDNA序列，分别命名为AtERF1、AtERF2、AtERF3、AtERF4和AtERF5。根据对它们所编码的蛋白氨基酸序列的比对分析结果，把它们分为三大类：Class I (AtERF1、AtERF2)，Class II (AtERF3、AtERF4)，Class III (AtERF5)。其中AtERF1、AtERF2和AtERF5为转录激活子，而AtERF3和AtERF4是转录抑制子。同年，Ohta等(2000)研究发现烟草(Nicotiana tabacum Nt)中的NtERF3也是一种转录抑制子。

Ohta等(2001)对Class II 类ERF和TFIII型ZFP (Zinc Finger Protein)转录抑制子的氨基酸序列比对分析发现在它们序列的C末端都含有一个保守基序(L/FDLN L/F(X)P)，进一步研究表明该序列是抑制作用所必需的，并且富含亮氨酸，具有双亲性，研究者称之为EAR基序。Hiratsu等(2002)在 ZFP家族的SUPERMAN蛋白中发现与ERF基序相似的保守序列(DLDLEL)，作者称之为类EAR基序(EAR-like motif)。后来，Tiwari等(2004)、Tsukagoshi等(2005)又分别在Aux/IAA(auxin/indoleacetic acid)及B3家族(B3 DNA-binding domain protein)的HSI(High-Sugar Induced)蛋白中发现与ERF基序相似的保守序列(LxLxL, I/LDLNS/FXP)。本文用EAR型转录抑制子一词表示这类含有EAR基序或类EAR基序的转录抑制子。

2 EAR型转录抑制子的特征
2.1 EAR型转录抑制子的分布特征
EAR型转录抑制子是一类普遍存在于植物界并为植物所特有的的转录抑制子。在多种植物常见的转录因子如ERF、ZFP等家族中都发现了EAR型转录抑制子 的存在(表1)。由表1可见，EAR型转录抑制子不仅存在于单子叶植物中，还存在于双子叶植物中。目前，在动物界还没有发现与EAR基序同源的抑制序列。

表1 EAR型转录抑制子的来源和类型 Table 1 The origins and types of EAR-type transcription repressors

2.2 EAR型转录抑制子的序列特征
EAR基序是EAR型转录抑制子的共同特征。当缺失EAR基序时，转录抑制子失去抑制功能，表明EAR基序是该型抑制子的抑制作用所必需的(Ohta et al., 2001)；EAR基序中氨基酸残基改变将导致抑制功能的降低或缺少(Ohta et al., 2001；Tiwari et al., 2001,2004)，如AtERF3的EAR基序 (LDLNLA P)中的D氨基酸残基被A取代，将使转录抑制子失去抑制功能(Ohta et al., 2001)；EAR基序富含亮氨酸，其中亮氨酸是十分保守的，对已报道的该类保守序列对比分析发现，亮氨酸占有较大的比例，其中第二个亮氨酸是完全保守的 (杜娟等, 2008)。实验表明，亮氨酸具有非常重要的作用，Tiwari等(2004)以IAA17为代表，通过原生质体转染实验，发现亮氨酸的突变将导致抑制功 能的弱化或缺失，其中第二个L的突变影响最大。

除EAR基序外，不同家族的EAR型转录抑制子还具有不同的DNA结合域，如ERF类含有AP2/ERF域、ZFP类含有锌指结构域、B3类 含有B3结构域(Hao et al., 1998; Takatsuji, 1998; Tsukagoshi et al., 2005; Suzuki et al., 2007; Lewis et al., 2007)等。另外，也有个别EAR型转录抑制子无DNA结合域(Weigel et al., 2005; Chern et al., 2005)，但是它们必须和具有DNA结合域的特定的蛋白因子结合后才具有抑制作用。如拟南芥中的NIMIN2和水稻中的NRR(Chern et al., 2005)。

3 EAR型转录抑制子的生物学功能
EAR型转录抑制子表现出多方面的生物学功能。

3.1参与非生物胁迫响应过程的调控
在生命周期中，植物体常常面临许多非生物逆境的胁迫，EAR型转录抑制子参与非生物胁迫响应过程的调控。例如，ZAT7基因超表达的转基因拟南芥植株，对 盐的抗性提高，而ZAT7中EAR基序缺失或突变转化实验中，转基因植株对盐的抗性消失，(Ciftci-Yilmaz et al., 2007)。Song 等(2005)报道，AtERF7的超表达 降低保卫细胞对ABA的敏感性，水分损失增加，植株抗耐旱能力降低。Kam等(2008) 发现TaZFPs家族中的一些EAR型转录抑制子也与抗干旱相关。大豆GmERF4基因超表达载体转化烟草，转基因植株抗盐和干旱胁迫能力大大增强 (Zhang et al., 2010)。另外，DEAR1能够抑制低温反应基因的低温诱导表达，降低植株抗低温能力(Tsutsui et al., 2009)。

3.2参与生物胁迫响应过程的调控
Nasir等(2005)用病毒诱导基因沉默研究发现，NbCD1基因是本生烟草(N.benthamiana)对病原假单胞菌(Pseudomonas cichorii)产生非寄主抗性(non-host resistance)所必需的，通过下调其它防卫基因的表达，NbCD1促使植物体产生非寄主抗性。DEAR1超表达转基因植株对病原菌抗性增加 (Tsutsui et al., 2009)。 GmERF4超表达的转基因植株中，下游基因(PR1, PR2, PR4, Osmotin 和 SAR8.2)表达水平明显降低，植株失去对病原细菌的抗性(Zhang et al., 2010)。实验表明，EAR型转录抑制子也与生物胁迫反应过程密切相关。

3.3参与编程性和过敏性死亡过程的调控
细胞编程性和过敏性死亡是生物体内重要的生理过程，研究表明EAR型转录抑制子参与此过程的调控。单态氧(singlet oxygen)和超氧自由基(superoxide radicals)两种活性氧(reactive oxygen species)能启动编程性死亡过程。对不同类型细胞编程性死亡共有阶段的研究发现，一系列新的基因被高调表达，其中包括Zat11，并发现ZAT11是被单态氧和超氧自由基调节最明显的转录因子。暗示ZAT11这种C₂H₂型锌指蛋白在活性氧介导的编程性死亡过程中发挥着重要作用(Gechev et al., 2005)。而马铃薯晚疫病菌分泌的主要激发子INF1(the major secreted elicitin of Phytophthora infestans)和非寄主病原菌P. cichorii可以诱导细胞过敏性死亡，NbCD1的抑制作用是这个过程所必须的(Nasir et al., 2005)。DEAR1的超表达可引起转基因植株中叶片、茎等器官中组织细胞的死亡(Tsutsui et al., 2009)。

3.4参与胚胎发生、器官发育和老化过程的调控
胚胎发生、器官发育和个体老化是植物体的基本生命过程，EAR型转录抑制子是这些过程不可或缺的调控因子，没有EAR型转录抑制子功能的正常发挥，这些过 程将不能正常进行。例如，SUPERMAN是一种与花器官发育相关的转录因子，该转录因子的C末端含有一个EAR基序，是一种EAR型转录抑制子。缺少 EAR基序的SUPERMAN基因的异位表达导致相似于spuerman基因突变子的表型，表明SUPERMAN基因的抑制活性是花器官的正常发育所必不 可少的(Hiratsu et al., 2002)。Szemenyei等(2008)研究发现EAR型转录抑制子IAA12/BDL能促进拟南芥胚胎发育中根和维管系统的发育，Kam等 (2008)报道TaZFPs类EAR型转录抑制子与叶片发育和老化有关。

4 EAR型转录抑制子的调控机制
4.1 EAR型转录抑制子是主动转录抑制子
真核生物中转录抑制子分为主动转录抑制子(Active Transcription Repressor)和被动转录抑制子(Passive Transcription Repressor)两大类。被动转录抑制子不含有任何特异的抑制域，它们通过与具有相同DNA结合位点的转录激活子竞争而实现它们的抑制功能 (Cowell et al., 1994; Hanna-Rose et al., 1996)。相反，主动转录抑制子除DNA结合域外，还包含一个内在而必要的抑制功能域(Cowell et al., 1994; Hanna-Rose et al., 1996)，通过染色体结构修饰(如组蛋白的去乙酰化)或者与激活子互作等机制行使抑制功能(Thiel et al., 2004; Kazan et al., 2006)。EAR型转录抑制子属于主动转录抑制子(Ohta et al., 2001)。

4.2 EAR型转录抑制子具有双向的调控功能
ZAT10基因编码ZAT10蛋白是ZFP家族的一种EAR型转录抑制子，Mittler等(2006)发现ZAT10超表达时，活性氧防卫转录本(reactive oxygen-defense transcripts)积累增加，植物对盐、热和渗透胁迫的抗性提高。同时发现敲除ZAT10基因或该基因的RNAi干涉突变体，也对盐和渗透胁迫具有较高的抗性。暗示ZAT10对植物防卫反应具有正负双向调控功能。

4.3 EAR型转录抑制子的抑制作用既可以发生在分子内又可以发生在分子间
EAR基序赋予转录抑制子对下游基因的抑制活性，当该基序与转录激活子共价结合成嵌合蛋白分子时也可使后者转变为转录抑制子，表现出分子内抑制作用。在 瞬时表达测验中，当把含有激活子表达盒质粒与含有抑制子表达盒的质粒进行共转化时，报道子的表达水平比用含有激活子表达盒的质粒单独转化要低的多。实验结 果说明，EAR型转录抑制子的抑制作用还还可以发生在分子间 (Fujimoto et al., 2000; Ohta et al., 2001)。

4.4 EAR型转录抑制子抑制活性可以通过不同的途径实现
EAR型转录抑制子可以通过修饰染色质的结构，阻止转录激活子和其靶标顺式元件的结合，抑制转录起始过程(Pazin et al., 1997)。如AtERF7与保守的启动子元件GCC box 结合后，征募AtSin3 和HDA19两种蛋白因子参与到转录单位中，其中AtSin3是一个辅助抑制因子，而HDA19是组蛋白脱乙酰酶。AtERF7可能是通过组氨酸脱乙酰化修饰改变染色质实现对基因表达的抑制作用。

EAR型转录抑制子也可以通过和转录激活子直接或间接的结合，调节后者功能状态，实现对后者功能的抑制作用。Weigel et al报道(2005)， 拟南芥中NIMIN1本身不含有任何DNA结合位点，通过NIM1/NPR1和TGA家族转录激活子间接结合实现对下游基因(PR1)的抑制。NIM1或 称为NPR1是一种对PR1表达具有正调控作用的锚蛋白。水稻的NRR通过和拟南芥中NIMIN相似的机制实现PR1基因表达的负调控(McGrath et al., 2005; Chern M et al., 2005)。

4.5 EAR型转录抑制子活性的去除
细胞内EAR型转录抑制子活性如何去除也是研究者关注的问题，研究发现泛素-蛋白酶体途径是植物组织细胞去除抑制子活性的重要机制。核蛋白酶体 (nuclear proteasome)是蛋白质降解的场所，在生物和非生物胁迫刺激作用下内源激素浓度发生改变，可以启动泛素-核蛋白酶体途径特异性降解EAR型转录抑 制子，去除对转录的抑制作用。如当外源生长素处理或内源生长素浓度增加时，可看到依赖生长素的AUX/IAA蛋白被转移到核蛋白酶体中，最终 AUX/IAAs蛋白失活，导致生长素响应基因转录活化(Tao et al., 2005)。再如，当乙烯浓度增大时，AtERF4反应性降解，释放出激活子(如ERF1或AtERF2)，去除对激活子的抑制，从而使后者发挥激活功能，促使PDF1.2(Plant defensin)基因的表达(McGrath et al., 2005)，这时在核蛋白酶体中看到AtERF4存在(Yang Z et al., 2005)。另外，Koyama等(2003)报道，烟草中ERF3可以和泛素连接酶发生相互作用。Song等(2005)报道，在互作蛋白PKS3作用下，AtERF7发生磷酸化作用而降解，或同DNA结合能力降低，抑制作用去除。说明磷酸化作用可能是去除EAR型转录抑制子抑制作用重要的步骤。

5嵌合抑制子沉默技术的概念及应用
对于EAR型转录抑制子结构和功能等方面的研究已经发展出一种新的抑制技术，即嵌合抑制子基因沉默技术(Chimeric Repressor Gene-Silencing Technology CREST)。在激活子C末端附加一段来自于EAR型转录抑制子的EAR基序，融合形成嵌合蛋白，可将其转变为一个高效的负调控子，再将它们通过转基因手 段转入植物中，用于对目标基因进行特异而高效的表达抑制，被称为嵌合抑制子沉默技术。该技术可用于鉴定转录激活子功能、研究蛋白质相互作用、改良作物性 状，是继反义RNA和RNAi技术之后，进行基因沉默的又一项新技术，具有理论是实践的重大意义(Hiratsu et al., 2003; Mitsuda et al., 2005, 2006; Kam et al., 2008)。

5.1鉴定转录因子基因的功能
CREST的最大优点是可以克服基因冗余性的影响，可用于鉴定转录因子的功能。同家族的多个转录因子成员之间同源性很高，表现出基因冗余性，而具有冗余性 基因的缺失没有突变表型，至今没看到ERF类转录因子的任何功能缺失突变体的报道(Yang et al., 2005)。所以，当采用基因敲除、反义技术、RNA干涉技术对这些基因的生物学功能进行鉴定分析时，经常会因为同源基因的功能补偿作用而失败。 Hiratsu等(2003)用EAR基序和多种不同的转录因子氨基酸序列融合，即使转录因子存在冗余性的情况下，也会出现显性缺失表型。生长素合成的调 控过程对植物正常生长和发育是十分重要的，阻断拟南芥生长素的合成过程将导致严重畸形。SHORT-INTERNODES/ STYLISH(SHI/STY)家族STY1因子诱导下，拟南芥幼苗中生长素合成和积累速率加快，促进生长发育，并且SHI/STY家族成员的功能具有 冗余性。用携带STY1+SRDX(修饰过的EAR基序)融合载体转化拟南芥，转基因幼苗不能分化出顶端分生组织，有力证实了STY1等SHI/STY家族成员具有顶端分生组织的形成和维持的重要作用(Eklund, et al., 2010)。

5.2研究蛋白质之间的相互作用
EAR基序可以通过蛋白质和蛋白质相互作用介导分子间的转录抑制作用，把一个转录复合物转化成转录抑制复合体，因此根据EAR基序介导的反式转录抑制活性 的有无，来确认蛋白质和蛋白质之间是否发生相互作用，对于研究蛋白质和蛋白质之间互作和确定转录蛋白复合体的组成成分是十分有用的。构建预期蛋白与EAR 基序融合蛋白载体，和转录激活子基因载体共转化，通过观察转录激活子的激活作用是否被抑制来判断激活子和预期蛋白间是否发生相互作用。WD40蛋白是一类 含有WD40基序的调节蛋白，WD40基序是指以甘氨酸-组氨酸开始，色氨酸(W)-天冬氨酸(D)结尾的40个氨基酸残基长的保守序列，WD40蛋白是 具有多种调节功能的蛋白因子(Yang et al., 2008)，调节作用通过蛋白质-蛋白质互作方式进行。Matsui等(2010)用此种方法确认了拟南芥中WD40蛋白AtPWP2 (periodic tryptophan protein2)和转录因子AtTBP1(TATA binding protein 1)可以发生相互作用。

5.3改变植物性状
利用CREST可以抑制控制不良性状的基因表达或抑制优良性状抑制基因的激活，从而可以改变植物的性状，因此对农作物性状的改良具有很大的潜在价值。如高 含量棉酚的存在是棉花植株防御病虫危害的重要途径。但是，棉酚的存在使棉籽油和棉籽蛋白不能用于人畜食用。培育棉株中棉酚含量高，而种子中棉酚含量低或无 棉酚(即“一高一低”)的棉花新品种是棉花育种科学家们的目标之一(朱美霞等, 2004)。棉酚产生过程中催化杜松烯羟基化形成8一羟基一杜松烯是一种P450酶。该种P450酶在有腺体棉中是高度表达的，而在无腺体棉中，不表达或 低水平表达，且该P450酶的表达受转录水平的调节。因此，可以设想利用CREST把调控该p450酶表达的转录激活子和EAR基序融合成嵌合蛋白体，并 让其只在种子中特异表达，这样就有望实现“一高一低”的育种目标。

6展望
综上所述EAR型转录抑制子是一类普遍存在于植物界并为植物所特有的转录抑制子, 是参与调节植物多种生命活动的重要因子，有关EAR型转录抑制子的研究丰富了我们有关植物生命活动的知识，深化了对生命活动调节规律的理解。但是，对其结 构和功能的认识还不够全面和深入，对其作用机制的理解仍有很多逻辑空白，CREST技术体系本身还有待于进一步发展、成熟和完善，存在诸多亟待解决的问 题。

为了描述的方便，我们把多种与EAR基序相似的抑制序列归属在EAR基序的范畴之内，并在此基础上使用EAR型转录抑制子这一概念。这些EAR基序虽然具 有相同的特点(抑制功能所必需、富含亮氨酸、具有双亲性)，但在序列上仍然是多有变化。另据Matsui等(2008)报道，R3-MYB蛋白家族成员 AtMYBL2也是转录抑制子，序列分析发现它的C末端也存在一个必要的富含亮氨酸的抑制序列(TLLLFR)，作者认为这一抑制序列是不同于EAR基序 的一种新的抑制序列，原因是该序列不具有典型的双亲性。由此看来双亲性并不是抑制作用先决条件，那么决定抑制子抑制功能的本质特征是什么？探究抑制基序的 本质特征有利于进一步弄清楚其抑制机理。

CREST技术可以克服基因冗余性，EAR基序对冗余基因家族不同成员间的抑制作用表现为较低的特异性。另据报道，CONSTANS(CO)因子通过诱导FLOWERING LOCUS T(FT)和SUPPRESSOR OF OVER-EXPRESSION OF CO1(SOC1)基因的表达促进开花。为了验证其功能，Takase等(2007)构建35S:CO-EAR-motif(CO-Rep) 嵌合蛋白超表达载体，转化拟南芥，形态正常的转基因植株在长日照诱导情况下，FT基因表达明显下调，而内源CO和SOC1基因的表达水平并没明显变化，抽 苔和开花时间比对照长两倍还多。揭示了转录激活子CONSTANS(CO)在光周期途径中有促进抽薹和开花的功能。但是，FT基因表达水平下调而SOC1 基因表达水平不变的现象说明EAR基序的这种抑制作用对不同家族基因来说，表现出较高水平的特异性。这种抑制作用特异性的水平和机制还不清楚，而弄清楚这 点将是完善和优化CREST技术的必要前提，因此应该是该领域研究的方向之一。

总之，随着对上述问题深入研究，CREST技术将进一步完善，这必将深化植物分子生物学理论认识，并为在农作物的品种改良工作中应用该技术提供扎实的理论和技术支持。

作者贡献
刘坤、李付广参与题目选定、总体思路和文章结构的确立、文献资料收集和梳理分析、初稿撰写与修改润色；张雪妍、刘传亮、张朝军和武芝霞参与文章结构修改、文字润色。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢 
本研究由国家863项目(2006AA100105)资助。作者感谢同行专家的评审及其给予的很好建议。

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